Новости

Aug 09, 2023

Проблемы и решения в разработке ПЦР-анализа

Фото: Себастьян Кондреа / Getty Images Разработка воспроизводимых ПЦР-анализов предполагает оптимизацию нескольких движущихся целей: от стандартизации каждого компонента в иногда мельчайших объемах реакции до

Фото: Себастьян Кондреа / Getty Images

Разработка воспроизводимых ПЦР-анализов включает в себя оптимизацию нескольких движущихся целей: от стандартизации каждого компонента в иногда незначительных объемах реакции до предварительного планирования, обеспечивающего долгосрочное и безопасное хранение реагентов, образцов и продуктов ПЦР.

Понимание сложностей и общих проблем, связанных с разработкой и оптимизацией диагностических тестов на основе ПЦР, поможет исследователям преодолеть такие препятствия, используя новейшие доступные решения. Здесь мы обсуждаем некоторые общие проблемы, с которыми могут столкнуться исследователи при разработке молекулярно-диагностического анализа на основе ПЦР, а также некоторые потенциальные решения.

Одной из первых проблем, с которыми приходится сталкиваться при разработке реакции ПЦР, является выбор оптимальной полимеразы для конкретного применения. Крайне важно взвесить ваши потребности с учетом характеристик биологического образца, длины последовательности, подлежащей амплификации, и желаемой точности последовательности амплифицированного продукта.

Джеральд Хантер, доктор философии, научный сотрудник Fortis Life Sciences, имеющий большой опыт в оптимизации ПЦР-анализов, говорит: «Различные ДНК-полимеразы обладают разной специфичностью, ферментативными функциями, частотой ошибок (точностью) и толерантностью к ингибиторам ПЦР».

Разработка праймеров, которые отжигаются с матрицами ДНК при заданной температуре с высокой специфичностью, и оптимизация состава реакционной смеси ставит следующие задачи.

«Успех в ПЦР основан на способности вашей реакции поддерживать низкий коэффициент связывания неспецифических праймеров, и поэтому температура отжига становится критическим фактором, который необходимо оптимизировать», — говорит Хантер. «Кроме того, необходимо учитывать компоненты буфера ПЦР — pH, соль, Mg2+, праймер и концентрацию фермента, которые играют важную роль в эффективности реакции и могут потребовать оптимизации».

Неспецифическая амплификация обычно происходит, когда праймеры связываются с последовательностями, для которых они не предназначены. Это приводит к получению непредназначенных продуктов.

«Дизайн букварей — это одновременно искусство и наука. Важна не только правильная концентрация праймеров, но и правильная последовательность праймеров», — говорит Хантер. «К счастью, существует множество бесплатных онлайн-программ для разработки праймеров, которые можно использовать для разработки праймеров для ПЦР, но не удивляйтесь, если вам придется протестировать несколько наборов пар праймеров, прежде чем вы найдете правильную комбинацию».

Один из способов избежать неспецифической амплификации — готовить реакционную смесь на льду до тех пор, пока вы не будете готовы вставить пробирку или стрип для ПЦР в термоциклер. Низкая температура снижает активность ДНК-полимеразы, уменьшая вероятность неточного связывания праймеров. Несмотря на эту предосторожность, нежелательные продукты все равно могут синтезироваться.

Дополнительным решением противодействия неспецифической амплификации является использование ДНК-полимеразы с горячим стартом. ДНК-полимераза горячего старта химически модифицирована, чтобы быть неактивной при комнатной температуре и предотвращать неспецифическую амплификацию. Нуклеотиды соединяются вместе модифицированным ферментом только после того, как произошел этап тепловой активации. Это позволяет проводить сборку реакции ПЦР при комнатной температуре, без возможности образования побочных продуктов и образования димеров праймера. Дополнительным преимуществом ПЦР с горячим стартом является то, что в качестве отрицательного контроля можно использовать условия циклической реакции без активации тепла.

Мультиплексирование — это возможность обнаружить ряд условий или факторов в рамках одного теста, в отличие от проведения отдельных тестов для каждого параметра.1 Это увеличивает пропускную способность, снижает затраты на тесты и повышает эффективность ухода за пациентами.

Мультиплексирование часто затрудняется дизайном праймера. Праймеры для мультиплексной ПЦР должны быть высокоселективными для целевого секвенирования и иметь постоянную температуру плавления, обеспечивающую получение ампликонов одинаковой длины. Это требует тщательного расчета при разработке праймеров. При неправильной разработке праймеры образуют гомо- или гетеродимеры или амплифицируют нецелевые последовательности.